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生物技術(shù)制藥 第四章抗體制藥 第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改造第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程第五節(jié)抗體診斷試劑第六節(jié)抗體治療藥物 第一節(jié)概述 1890年 Behring和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素 并建立了血清療法 開抗體制藥之先河 1937年 Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白 甲種 球蛋白 乙種 球蛋白和丙種 球蛋白 并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分 20世紀(jì)60年代初期 抗原決定簇 精制單價(jià)血清 1975年 K hler和Milstein等 單克隆抗體 其具有高度特異性 均一性 以及來(lái)源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點(diǎn) 1984年 人 鼠嵌合抗體1984年至今 單克隆抗體的鼠源性及分子過(guò)大的問(wèn)題得以解決 可僅作為與抗原特異性結(jié)合試劑 單克隆抗體的應(yīng)用 用于疾病的診斷和治療 如利用單克隆抗體檢測(cè)與某些疾病相關(guān)的抗原 輔助臨床診斷 或用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像 進(jìn)行免疫鑒定 用于臨床治療 如針對(duì)T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體 用作免疫抑制劑 單克隆抗體還可作為載體制備導(dǎo)向藥物 但是要解決以下兩個(gè)問(wèn)題 1 鼠源性單克隆抗體的免疫原性 2 完整的抗體分子分子量過(guò)大 難以穿透實(shí)體腫瘤組織 達(dá)不到有效的治療濃度 單克隆抗體的應(yīng)用 基因工程技術(shù)為解決這兩個(gè)問(wèn)題提供了可能 已通過(guò)基因工程技術(shù) 制備出改形抗體 單鏈抗體 單域抗體 最小識(shí)別單位等很多類型的抗體或抗體單位 基本消除了單克隆抗體的鼠源性 相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1 80 1 3 而且鼠源性單克隆抗體的生物學(xué)活性如激活補(bǔ)體 促進(jìn)吞噬功能 免疫調(diào)理 抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等 只保留同抗原特異性結(jié)合的活性 第二節(jié)單克隆抗體 單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合 通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而生產(chǎn)的 由于這種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的抗體 又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的 因此稱為單克隆抗體 它是結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體 制備的一般流程見下圖 單克隆抗體和多克隆抗體的制備 脾 B淋巴細(xì)胞 融合 融合 淋巴細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 克隆1 克隆2 克隆3 克隆4 第二節(jié)單克隆抗體 一 抗原與動(dòng)物免疫二 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)三 篩選陽(yáng)性克隆與克隆化四 雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定五 單克隆抗體的大量制備六 單克隆抗體的純化 一 抗原與動(dòng)物免疫 1 制備用于動(dòng)物免疫的適當(dāng)抗原 化學(xué)合成抗原 如精制的地高辛 多數(shù)情況下抗原物質(zhì)只能得到部分純化 甚至是極不純的混合物 如部分純化的干擾素 通過(guò)克隆化選出最適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w 在制備惡性腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體時(shí) 情況較復(fù)雜 需用整個(gè)腫瘤細(xì)胞做為免疫原 經(jīng)過(guò)篩選 克隆化 制備出僅存在于腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞上的表面標(biāo)志分子上的單克隆抗體 一 抗原與動(dòng)物免疫 2 穩(wěn)定的雜交瘤的獲得因免疫動(dòng)物品系和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn) 產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定 故一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫 目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來(lái)自BALB c小鼠和Lou大鼠 因此免疫動(dòng)物也多采用相應(yīng)的品系 最常用的也是BALB c小鼠 選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮到動(dòng)物品系的免疫應(yīng)答基因 Ir 對(duì)抗原免疫應(yīng)答的影響 不同品系的小鼠與大鼠在對(duì)某類抗原的免疫應(yīng)答上是不同的 書中表4 1是骨髓瘤細(xì)胞系一覽表 可以參考 一 抗原與動(dòng)物免疫 3 免疫方法 體內(nèi)免疫法和體外免疫法體內(nèi)免疫法 適用于免疫原性強(qiáng) 抗原量較多時(shí)應(yīng)用 一般用8 12周齡的雌性鼠 顆粒性抗原 如細(xì)菌 細(xì)胞抗原 的免疫原性強(qiáng) 可不加佐劑 直接注入腹腔107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫 間隔1 3周 再追加免疫1 2次 可溶性抗原則按每只小鼠10 100 g抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi) 進(jìn)行初次免疫 間隔2 4周 再用不加佐劑的原抗原追加免疫1 2次 一般在采集脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原 其目的是使對(duì)應(yīng)的B淋巴細(xì)胞克隆受到可靠的最大限度的刺激 使其迅速地增殖分裂 因?yàn)榧?xì)胞融合后增殖最好的細(xì)胞是迅速分裂的細(xì)胞 有人認(rèn)為在常規(guī)免疫的基礎(chǔ)上用脾內(nèi)免疫法做追加免疫較佳 一 抗原與動(dòng)物免疫 3 免疫方法 體內(nèi)免疫法和體外免疫法體外免疫法 用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況下 如制備人源性單克隆抗體 或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時(shí)使用 體外免疫法所需要的抗原量少 一般只需幾個(gè) g 免疫期短 僅4 5天 干擾因素少 已成功制備出針對(duì)多種抗原的單克隆抗體 但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株不夠穩(wěn)定 其基本方法是用4 8周齡BALB c小鼠的脾臟制成單個(gè)細(xì)胞懸液 再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0 5 5 g ml 在5 CO2 37 下培養(yǎng)4 5天 再分離脾臟細(xì)胞 進(jìn)行細(xì)胞融合 二 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 1 細(xì)胞融合基本方法 取適量脾細(xì)胞 1 108 與骨髓瘤細(xì)胞 2 107 3 107 進(jìn)行混合 在聚乙二醇 PEG 作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?時(shí)間控制在2min以內(nèi) 然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋 2 用于融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備條件 融合率高 自身不分泌抗體 所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長(zhǎng)期穩(wěn)定等特點(diǎn) 書中表4 1列舉了主要的骨髓瘤細(xì)胞系 其中SP2 0 P3 653細(xì)胞本身不分泌抗體 細(xì)胞融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞只分泌均一的 完全來(lái)自脾細(xì)胞的抗體分子 它們是目前較為理想的可供融合的骨髓瘤細(xì)胞 特別是SP2 0細(xì)胞系還具有容易培養(yǎng) 融合率高等特點(diǎn) 被國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛采用 二 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 3 誘導(dǎo)劑PEG的影響 PEG分子量以及濃度越大 促融率越高 但其粘度和對(duì)細(xì)胞的毒性也隨之增大 目前常用的PEG的濃度為40 50 相對(duì)分子質(zhì)量以4000為佳 但相對(duì)分子量400 6000 濃度在10 50 范圍之間的PEG都能使細(xì)胞融合 為了提高融合率 在PEG溶液中加入二甲基亞砜 DMSO 以提高細(xì)胞接觸的緊密性 增加融合率 但是 PEG和DMSO都對(duì)細(xì)胞有毒性 必須嚴(yán)格限制它們和細(xì)胞的接觸時(shí)間 可通過(guò)低速離心5min使細(xì)胞接觸更為緊密 然后用新配制的培養(yǎng)液來(lái)稀釋藥物并洗滌細(xì)胞 二 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 4 培養(yǎng)基的正確選擇 常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基 它是次黃嘌呤 H 氨基喋呤 A 和胸腺嘧啶 T 配制的 其中氨基喋呤 A 能阻斷DNA合成的主要途徑 瘤 瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成DNA而死亡 脾 脾融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞在這樣的條件下 幾天內(nèi)亦迅速死亡 由于SP2 0等骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤 H 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 HGPRT 缺乏株 脾細(xì)胞中卻有這種酶 因此脾 瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRT酶 用次黃嘌呤 H 和胸腺嘧啶 T 合成DNA 使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng) 二 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 5 選擇性培養(yǎng)方法 通常將融合的細(xì)胞懸浮于HAT的培養(yǎng)液 配方見書中表4 2 加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi) 根據(jù)情況每2 3天換液一次 換液時(shí)吸去1 2 2 3培養(yǎng)液 加入等量的新鮮培養(yǎng)液 在融合后7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液 殺死瘤 瘤融合細(xì)胞后 第7 14天改用HT培養(yǎng)液 14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液 配方書中表4 3 從融合后8 9天就可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè) 篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆 二 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 6 飼養(yǎng)細(xì)胞 由于在最適的條件下大約有105個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞 大量瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡 單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不能存活 所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等 一般認(rèn)為飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長(zhǎng)刺激因子 并能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞 故應(yīng)用的較多 三 篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 1 篩選陽(yáng)性克隆 因?yàn)楫a(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5 左右 所以要進(jìn)行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作 以選擇出陽(yáng)性克隆 然后進(jìn)行克隆化培養(yǎng) 為了盡快地篩選出陽(yáng)性克隆 必須采用微量 快速 特異 敏感 簡(jiǎn)便并一次能檢測(cè)大批標(biāo)本的方法 常用的檢測(cè)方法有免疫酶技術(shù) 免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)等 一般來(lái)說(shuō) 免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測(cè) 免疫熒光技術(shù)適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè) 特別是制備以檢測(cè)患者活檢組織標(biāo)本為目的的抗體時(shí) 免疫熒光法更有意義 在篩選抗體的同時(shí) 還能對(duì)所識(shí)別的抗原進(jìn)行定位判定 1 精制破傷風(fēng)毒素抗原 吸附 約10 g ml 4 3h 洗滌 2 加雜交瘤培養(yǎng)上清液 4 1h 3 加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體 4 1h 洗滌 洗滌 4 加酶作用底物 呈色孔為陽(yáng)性克隆孔 ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選 三 篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 2 克隆化 有限稀釋法和軟瓊脂法篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中 可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞 而且剛剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定 染色體容易丟失 因此應(yīng)盡早克隆化 一般融合后獲得的雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過(guò)大約3次的克隆化 才能達(dá)到100 孔內(nèi)均為抗體陽(yáng)性細(xì)胞克隆 常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法 有限稀釋法是把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后 加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞 第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液 以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液 由于單個(gè)細(xì)胞難以存活 克隆化時(shí)也需加入飼養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長(zhǎng) 三 篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 2 克隆化 有限稀釋法和軟瓊脂法軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0 5 左右的瓊脂糖凝膠 細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊 由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài) 可用毛細(xì)吸管將小球吸出 團(tuán)塊打碎后 移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng) 用這種方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng) 因初代細(xì)胞很不易增殖 所以用軟瓊脂法進(jìn)行克隆化容易成功 四 雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 1 雜交瘤細(xì)胞的鑒定正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)為40 全部是端著絲粒染色體 小鼠骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)變異較大 SP2 0細(xì)胞為62 68 NS 1細(xì)胞為54 64 大多數(shù)為非整倍性 并且有中部著絲點(diǎn)染色體和亞中部著絲點(diǎn)染色體 雜交瘤細(xì)胞的染色體在數(shù)目上接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和 在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲粒染色體外 還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體 染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌高效價(jià)的抗體 而染色體數(shù)目少且比較分散的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力較低 四 雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 2 抗體性狀的鑒定由于不同類和不同亞類的免疫球蛋白生物學(xué)特性差異較大 諸如補(bǔ)體活化 免疫調(diào)理 ADCC效應(yīng)等等 因此要對(duì)制備的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體 進(jìn)行Ig類和亞類的鑒定 可用羊或兔抗Ig不同類和亞類的抗體 進(jìn)行免疫擴(kuò)散或ELISA法來(lái)鑒定 在單克隆抗體鑒定中還必須進(jìn)行親和力測(cè)定 它可為正確選擇不同用途的單克隆抗體提供依據(jù) 另外根據(jù)需要不同 還應(yīng)對(duì)單克隆抗體的特異性 純度和識(shí)別抗原的相對(duì)分子量等進(jìn)行測(cè)定 五 單克隆抗體的大量制備 1 體外培養(yǎng)法可獲得10 g ml的抗體 2 動(dòng)物體內(nèi)誘生法 可獲得5 20mg ml的抗體 目前多采用后者生產(chǎn)制備單克隆抗體 因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞均來(lái)自BALB c小鼠 所以應(yīng)選用BALB c小鼠來(lái)制備單克隆抗體 為了使雜交瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)增殖良好 可于注入細(xì)胞的幾周前 預(yù)先將具有刺激性的有機(jī)溶劑降植烷 pristane 注入腹腔內(nèi) 以破壞腹腔內(nèi)膜 建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境 動(dòng)物體內(nèi)誘生法操作簡(jiǎn)便 也比較經(jīng)濟(jì) 所得單克隆抗體量較多且效價(jià)亦高 還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株 缺點(diǎn)是小鼠腹水中混有來(lái)自小鼠的多種雜蛋白 給純化帶來(lái)難度 五 單克隆抗體的大量制備 書中介紹了體外培養(yǎng)法和動(dòng)物體內(nèi)誘生法的具體步驟以及其它一些近來(lái)發(fā)展的方法 這里不一一介紹 利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細(xì)胞生長(zhǎng)空間 雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛 單克隆抗體產(chǎn)量得到提高 連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可達(dá)2 0 107細(xì)胞 ml 收集的單克隆抗體可達(dá)到400 g ml左右 如在培養(yǎng)液中加入固體顆粒作為細(xì)胞生長(zhǎng)的載體 增大單位體積的表面積 利于雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng) 細(xì)胞密度可達(dá)108細(xì)胞 ml 并能收獲更多的單抗 此稱為微載體懸浮培養(yǎng)法 固體顆粒用DEAE SephadexA50等材料制成 六 單克隆抗體的純化 動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體方法及過(guò)程1 澄清和沉淀處理小鼠腹水中含有紅細(xì)胞 細(xì)胞碎塊 纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等 應(yīng)首先用離心力1000g離心5min 去除殘留的小顆粒物質(zhì) 再用0 2 m的微孔濾膜過(guò)濾 除掉污染的細(xì)菌 支原體和脂質(zhì) 用飽和硫酸銨沉淀抗體 50 飽和硫酸銨能回收90 以上的單克隆抗體 2 分離根據(jù)用途可選用不同的方法 主要分離方法有凝膠過(guò)濾 陰離子交換層析 親和層析等 六 單克隆抗體的純化 2 分離 1 凝膠過(guò)濾用于IgG和IgM類單克隆抗體的分離純化 常用SephadexG200作分離介質(zhì) 可收集到三個(gè)峰 最高峰為IgM 另兩個(gè)峰為IgG 抗體回收率達(dá)50 80 能去除污染的微量雜蛋白 抗體純度可達(dá)95 以上 2 陰離子交換層析用于IgG類單克隆抗體的分離純化 在pH7 4條件下 IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上 其中IgG2a可在較低離子強(qiáng)度條件下洗脫下來(lái) 其純度較高 IgG2b IgG3在低離子強(qiáng)度下易發(fā)生沉淀 可增加離子強(qiáng)度以提高產(chǎn)量 但其純度相對(duì)較低 在pH5 5條件下 把雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液加到瓊脂糖柱上時(shí) 所有的抗體都能結(jié)合到柱上 而55 的雜蛋白可被洗脫掉 再用不同離子強(qiáng)度的洗脫劑洗下 續(xù) 2 離子交換法在最適離子強(qiáng)度及pH條件下 以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化25 100倍 高容量 高流速 化學(xué)穩(wěn)定的新型離子交換劑適宜單克隆抗體的大規(guī)模純化 3 親和層析多用蛋白A親和層析 適用于IgG類單克隆抗體的純化 IgG與蛋白A的結(jié)合與pH有密切關(guān)系 鼠源性單克隆抗體在pH8 0時(shí) IgG2b IgG3幾乎全部結(jié)合于蛋白A柱上 IgG1稍差 用pH3 5緩沖液可洗脫IgG2b pH4 0緩沖液可洗脫下IgG3 pH4 5緩沖液可洗脫下IgG2a pH6 0可洗脫下IgG1 用蛋白A親和層析收獲的抗體純度很高 但也有極微量的雜蛋白 第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改進(jìn) 改造鼠源性單克隆抗體的目的 一是降低免疫原性 二是降低相對(duì)分子量 增加組織通透性 如將鼠源性單克隆抗體的C區(qū)用人的Ig分子的C區(qū)置換 則對(duì)人的免疫原性消失 對(duì)鼠源性抗體的改造已有很多成果報(bào)道 見書中表4 4 給出了改造后的單抗的類型和特性 有人 鼠嵌合抗體 人IgC 小鼠IgV 150000 改形抗體 將小鼠CDRs替換為人CDRs 150000 Fab 完整L鏈和Fd 50000 FV VH和VL 25000 單鏈抗體 SCFV VH 多肽 VL 27000 單域抗體 VH或VL 12500 最小識(shí)別單位 MRU 一個(gè)CDR 2000 一 人 鼠嵌合抗體 制備方法 提取雜交瘤細(xì)胞系的mRNA 經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 并以其為模板 采用特異引物 用PCR方法分別擴(kuò)增VL和VH基因 再分別連接真核表達(dá)所需的上游啟動(dòng)子 前導(dǎo)肽序列和下游剪切供體信號(hào) 增強(qiáng)子真核調(diào)控序列后 將VL基因克隆到人Ig的CL基因表達(dá)載體上 將VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表達(dá)載體上 再將人 鼠嵌合的V C區(qū)基因質(zhì)粒DNA等量混合 在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞SP2 0 轉(zhuǎn)染后用含霉酚酸進(jìn)行篩選 形成集落的細(xì)胞即為共轉(zhuǎn)染細(xì)胞 所分泌的抗體為嵌合抗體 它保持鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合的特異性 但對(duì)人的免疫原性大幅下降了 如若用人IgG1或IgG3的C基因替換鼠IgG1或IgG2b 則可有效地加強(qiáng)多肽的ADCC效應(yīng)與免疫調(diào)理作用 二 改形抗體 Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)性決定區(qū) CDR區(qū) 而不是整個(gè)可變區(qū) H和L鏈各有三個(gè)CDR 其他部分稱為框架區(qū) 如果用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列 則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性 抗體分子中鼠源性部分只占很小比例 可基本消除免疫原性 這種改形抗體 reshapingantibody 又稱CDR移植抗體 CDRgraftingantibody 書中表4 5給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應(yīng)用 三 小分子抗體 基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段 其相對(duì)分子量?jī)H為原抗體的1 80 1 3 也就是說(shuō) 保留了CDR區(qū) 而Ig分子的C區(qū)不表達(dá) 現(xiàn)在研制的小分子抗體有以下幾種類型 1 Fab抗體 由完整的輕鏈和重鏈 VH和CH1 所組成 2 FV抗體 由VH和VL組成 天然FV片段中VH和VL為非共價(jià)性結(jié)合 3 單鏈抗體 singlechainantibodySCA或singlechainFV SCFV 由VH和VL通過(guò)一段連接肽 linker 連接而成的重組蛋白 有分子量小 穿透力強(qiáng) 免疫原性小特點(diǎn) 可與效應(yīng)分子相連接構(gòu)建新功能抗體分子 是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件 4 單域抗體 由VH VL 單個(gè)可變區(qū)組成的 只有抗體分子的1 12 而且表面疏水性強(qiáng) 與抗原非特異結(jié)合能力也強(qiáng) 5 最小識(shí)別單位 MRU 是由單個(gè)CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體 親和力較低 四 雙功能抗體 雙功能抗體就是雙特異性抗體 biospecificantibody BsAb 它是一種非天然性的抗體 其結(jié)合抗原的兩個(gè)臂具有不同的特異性 1 化學(xué)交聯(lián)法2 生物學(xué)方法 雜種 雜交瘤 雜交瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合得到可分泌兩種親代抗體和雜種抗體的雜種 雜交瘤細(xì)胞 3 基因工程方法采用適當(dāng)?shù)慕宇^連接不同抗體的VH和VL區(qū) 使它們不能形成鏈內(nèi)的分子內(nèi)配對(duì) 讓其形成原抗體的分子內(nèi)配對(duì) 構(gòu)建雙特異性 SCFV 2 五 抗體融合蛋白 類型有 1 配基 配基型融合蛋白 如CD4 Fc 2 配基 Ig嵌合型蛋白 如IL 2 Ig 3 配基 FV型嵌合蛋白 如CD4 FVCD3 40受體 FV型融合蛋白 5 酶 抗體型融合蛋白 其中較為成熟的是配基 Ig型嵌合蛋白 而酶 抗體型融合蛋白 即抗體酶 abeneyme 在藥物治療中應(yīng)用前景廣闊 它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物 避免對(duì)正常組織的傷害 此法稱為抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療 五 抗體融合蛋白 構(gòu)建抗體融合蛋白的原則是 將第一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除 再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因 即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因共表達(dá) 在抗體的N端和C端融合其它蛋白都可以獲得成功 關(guān)鍵是兩個(gè)蛋白間的接頭序列l(wèi)inker 一般說(shuō)來(lái)3 5個(gè)氨基酸就可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求 如加入一段有疏水性和一定伸展性的長(zhǎng)鏈 可緩解兩種蛋白的相互干擾 第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程 一 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法1 獲得目的基因2 抗體庫(kù)技術(shù)的載體 現(xiàn)在普遍使用噬菌粒 phagemid 載體 其中的pHEN1為新一代載體 轉(zhuǎn)化效率高 有利于提高庫(kù)容量 3 淘篩 抗原固定化后 對(duì)噬菌粒群的吸附 洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增 與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級(jí)文庫(kù) 再反復(fù)與抗原吸附 經(jīng)幾輪淘篩后 淘汰了非目的克隆 且使目的克隆大量擴(kuò)增 四 表達(dá)與鑒定 目的克隆經(jīng)過(guò)鑒定后 再導(dǎo)入感受態(tài)菌株 進(jìn)行可溶性表達(dá) 其產(chǎn)物用westernblot分析確定后 就完成了全過(guò)程 二 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn) 1 模擬天然全套抗體庫(kù)抗體文庫(kù) 1011庫(kù)容 能包含B細(xì)胞全部克隆 建庫(kù)的外源基因來(lái)自人外周血 骨髓或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增 使用的通用引物采自多個(gè)人體 具有人的種屬普遍性 VH和VL隨機(jī)重組增加抗體的多樣性 2 避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)3 可獲得高親和力的人源化抗體在噬菌體抗體庫(kù)中 VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟過(guò)程 所用抗體基因又都是來(lái)自人體 因此產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的 三 基因工程抗體的表達(dá) 1 原核細(xì)胞表達(dá)2 真核細(xì)胞表達(dá)3 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)4 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá) 第五節(jié)抗體診斷試劑 一 血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑1 鑒定病原菌的抗體試劑 診斷血清制備步驟 1 制備細(xì)菌抗原 O 菌體 抗原 H 鞭毛 抗原 2 免疫動(dòng)物和制備抗體血清2 乙型肝炎病毒表面抗原 HBsAg 的反向被動(dòng)血凝診斷試劑3 妊娠診斷試劑4 抗ABO血型系統(tǒng)血清 二 免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 給抗體標(biāo)記放射性核素 熒光素或酶活性 能將抗原抗體反應(yīng)放大 使常規(guī)方法難以觀察或檢測(cè)的反應(yīng)得以顯現(xiàn) 因而大幅度提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性 用于對(duì)微量抗原物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè) 結(jié)合顯微鏡或電子顯微鏡技術(shù) 還可對(duì)抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測(cè)定 除用于臨床診斷外 還能為探討發(fā)病機(jī)制提供有力的研究手段 免疫標(biāo)記技術(shù)有三種基本類型 免疫熒光技術(shù) 免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù) 二 免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 1 熒光抗體診斷試劑熒光色素如異硫氰酸熒光素 FITC 等標(biāo)記抗體球蛋白 即成為熒光抗體 用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞 熒光抗體與抗原集合 在熒光顯微鏡下成為可發(fā)光的可視物 從而達(dá)到診斷或定位的目的 1 熒光抗體的制備 2 免疫熒光測(cè)定法有直接和間接兩種方法 二 免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 2 免疫酶抗體診斷試劑免疫酶技術(shù)是用酶標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)抗原的方法 本法分為免疫酶染色 組化法 和酶免疫測(cè)定 EIA 兩種類型 1 免疫酶染色法用抗體診斷試劑 常用的酶為HRP 其底物為二氨基聯(lián)苯胺 DAB 兩者作用可生成棕褐色沉淀物質(zhì) 使抗原呈色 2 酶免疫測(cè)定用抗體診斷試劑 見書中介紹的幾種試劑 重點(diǎn)掌握酶免疫法的基本概念 比如ELISA方法 夾心法 間接法 3 放射免疫用抗體診斷試劑 三 導(dǎo)向診斷藥物 放射免疫顯像定位技術(shù) 第六節(jié)抗體治療藥物 一 放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物二 抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物三 毒素偶聯(lián)的抗體藥物