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無菌操作技術(shù) 組員 趙華趙詣陳珩杜宇菲高寶才高瑞鈺講解 高寶才PPT制作 杜宇菲高瑞鈺資料查找人 趙華趙詣陳珩 無菌操作技術(shù) 無菌 在科學研究和生產(chǎn)實踐中使用的微生物必須是單一的純種或菌株 不能存在雜菌 非目的菌 無菌操作 防止微生物進入機體或物體的方法 在微生物操作過程中 除了使用的容器 用具 試管 三角燒瓶 平皿和吸管等 和培養(yǎng)基必須進行嚴格的滅菌處理外 還要通過一定的技術(shù)來保證目的微生物在轉(zhuǎn)移過程中不被環(huán)境中的微生物污染 這些技術(shù)包括用接種環(huán) 針 吸管 涂棒等工具進行接種 稀釋 涂片 計數(shù)和劃線分離等 實驗目的 1 學習掌握培養(yǎng)基的配制原理 同時通過對幾種培養(yǎng)基的配制掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟 2 了解高壓蒸汽滅菌的原理和應(yīng)用范圍 學習高壓蒸汽滅菌的操作技術(shù) 3 證實實驗室環(huán)境與人體表面存在微生物 體會無菌操作的重要性 實驗目的 4 熟練掌握從固體培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)接微生物的無菌操作技術(shù) 熟知各種菌種保藏方法 以及各個方法的特點和區(qū)別 5 學習并掌握微生物的制片和簡單染色的基本技術(shù) 初步了解細菌的形態(tài)特征 鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無菌操作技術(shù) 實驗原理 1 培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物 培養(yǎng)基的原材料可分為碳源 氮源 無機鹽 生長因素和水 根據(jù)微生物的種類和實驗目的不同 培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法 實驗原理 2 高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi) 通過加熱 使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽 待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)地冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡 然后關(guān)閉排氣閥 繼續(xù)加熱 此時 由于蒸汽不能溢出 而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力 從而使沸點增高 得到高于100攝氏度的溫度 導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的 實驗原理 3 要知道我們周圍存在看得見的微生物可以通過兩種方法 一種是通過放大微生物個體 是我們能夠看到它們 另一種方法是通過 放大 成子細胞群體 菌落 使我們看到它們的存在 即通過培養(yǎng)的方法使肉眼看不見的單個菌體在固體培養(yǎng)基上 經(jīng)過生長繁殖形成幾百萬個菌聚集在一起的肉眼可見的菌落 實驗原理 4 高溫對微生物具有致死效應(yīng) 因此在微生物的轉(zhuǎn)接過程中 一般在火焰旁進行 并用火焰直接灼燒接種環(huán) 針 鏟 以達到滅菌的目的 但一定要保證其冷卻后方可進行轉(zhuǎn)接 以免燙死微生物 如果是轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)物 則用預先已滅菌的玻璃吸管或吸嘴 如果只取少量而且勿需定量也可用接種環(huán) 視實驗目的而定 實驗原理 5 通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物 還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時間內(nèi)不死亡 不會被其他微生物污染 不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學形狀 否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進行 保藏菌種的方法包括傳代培養(yǎng)保藏 冷凍保藏和干燥保藏 實驗原理 6 對個體較小的細菌進行制片時采取涂片法 通過涂抹使細胞個體在載玻片上均勻分布 避免菌體堆積而無法觀察個體形態(tài) 通過加熱固定使細胞質(zhì)凝固 使細胞固定在載玻片上 這種加熱處理還可以殺死大多數(shù)細菌而且不破壞細胞形態(tài) 實驗原理 7 利用單一燃料對菌體進行染色的方法稱為簡單染色 用于染色的燃料是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基因和助色基因的有機化合物 發(fā)色基因賦予燃料顏色特征 而助色基因使燃料能夠形成鹽 不含助色基因而僅具有發(fā)色基因的苯化合物 色原 即使具有顏色也不能用作燃料 因為它不能電離 不能與酸或堿形成鹽 難以與微生物細胞結(jié)合使其著色 常用的微生物細胞燃料都是鹽 分堿性染料和酸性燃料 前者包括美藍 結(jié)晶紫 堿性復紅 沙黃及孔雀綠等 后者包括酸性復紅 伊紅及剛果紅等 通常采用堿性燃料進行簡單染色 原因在于微生物細胞在堿性 中性及弱酸性溶液中通常帶負電荷 而燃料電離之后染色部分帶正電荷 很容易與細胞結(jié)合使其著色 當細胞處于酸性條件下所帶正電荷增加時 可采用酸性燃料染色 實驗材料 1 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 可溶性淀粉 KNO3 K2HPO4 3H2O MgSO4 7H2O FeSO4 7H2O KH2PO4 葡萄糖 孟加拉紅 1 的水溶液 鏈霉素 1 水溶液 1mol LNaOH 1mol LHCL 3 5 石炭酸或2 3 來蘇爾溶液 2 的葡萄糖溶液 無菌水 金黃色葡萄球菌24h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物 草酸銨結(jié)晶紫染液 齊氏石炭酸復紅染液 呂氏堿性美藍染液 革蘭氏染色用碘液 乳酸石炭酸棉藍染液等 實驗材料 2 試管 三角燒瓶 量筒 玻璃棒 培養(yǎng)基分裝器 天平 牛角匙 高壓蒸汽滅菌鍋 PH試紙 棉花 牛皮紙 記號筆 麻繩 紗布 培養(yǎng)皿 吸管 電熱干燥箱 紫外線燈 注射器 微孔濾膜過濾器 0 22um濾膜 鑷子 玻璃刮棒 滅菌棉簽 試管架 煤氣燈或酒精燈 廢物缸 接種環(huán) 無菌玻璃吸管 吸氣器 載玻片 蓋玻片 顯微鏡 雙層瓶 擦鏡紙 平皿 u型玻棒 滴管 解剖針 解剖刀 生理鹽水 50 乙醇 20 甘油 高氏一號培養(yǎng)基平板 馬鈴薯瓊脂薄層平板等 實驗步驟 一 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備牛肉膏3 0g蛋白胨10 0gNaCl5 0g水1000mLpH7 4 7 6 實驗步驟 1 稱量 按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏 蛋白胨 NaCl放入燒杯中 牛肉膏常用玻璃棒挑取 放在小燒杯或玻璃皿中稱量 用熱水融化后倒入燒杯 也可以放在紙上稱量 稱量后直接放入水中 這時如稍微加熱 牛肉膏便會與稱量紙分離 然后立即取出紙片 2 融化 在上述燒杯中先加入少許所需要的水量 用玻璃棒攪勻 然后 在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解 或在磁力攪拌器上加熱溶解 實驗步驟 3 調(diào)pH 在未調(diào)pH之前 先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基原始pH 如果偏酸 用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol LNaOH 邊加邊攪拌 并隨時用pH試紙測其pH 直到pH達到7 4 7 6 反之 用1mol LHCl進行調(diào)節(jié) 4 過濾 趁熱用濾紙或多層紗布過濾 以利某些實驗結(jié)果的觀察 一般無特殊要求的情況下 這一步可以省去 本實驗勿需過濾 實驗步驟 5 分裝 按實驗要求 可將配置的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)和三角燒杯內(nèi) 液體分裝 分裝高度以試管高度的1 4左右為宜 分裝三角燒瓶的量則根據(jù)需要而定 一般以不超過三角燒瓶容積的1 2為宜 如果是用于振蕩培養(yǎng) 則應(yīng)根據(jù)通氣量的要求酌情減少 有的液體培養(yǎng)基在滅菌后 須要補加一定量的無菌成分 如抗生素等 則裝量一定要準確 固體分裝 試管分裝 其裝量不超過管高的1 5 滅菌后制成斜面 分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶的容積的1 2為宜 半固體分裝 試管一般以試管高度的1 3為宜 滅菌后垂直待凝 實驗步驟 6 加塞 培養(yǎng)基分裝完畢后 在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞 或泡沫塑料及試管帽等 以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染 7 包扎 加塞后 將全部試管用麻繩捆綁好 再在面塞外包一層牛皮紙 以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞 其外再用一道麻繩包好 用記號筆注明培養(yǎng)基名稱 組別 配置日期 三角燒瓶加塞后 外包牛皮紙 用麻繩以活結(jié)形式扎好 使用時容易解開 同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱 組別 配置日期 實驗步驟 8 滅菌 將上述培養(yǎng)基以0 1MPa 121 20min高壓蒸汽滅菌 9 擱置斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50 左右 以防斜面上冷凝水太多 將試管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上 擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一般為宜 10 無菌檢查 將滅菌培養(yǎng)基放在37 的溫室中培養(yǎng)24 48h 以檢查滅菌是否徹底 實驗步驟 二 無菌試驗1 標記分別在兩套平板的底部劃分出四個小區(qū) 并在其邊緣上寫上自己的名字和日期 在四個小區(qū)內(nèi)分別標明待接種的樣品名稱 為了不影響觀察 可用符號或數(shù)字代表 在另外兩套平板的底部 用記號筆寫上姓名 日期以及 空氣1 和 空氣2 2 人體表面微生物的觀察手指表面 在火焰旁 半開皿蓋 用洗前的手指在平板的A區(qū)域輕輕按一下 迅速蓋上皿蓋 然后用肥皂洗手兩次 自然干燥后 在B區(qū)輕輕按一下 迅速蓋上皿蓋 實驗步驟 3 實驗室環(huán)境的檢查 將標有 空氣1 的平板在實驗室打開皿蓋 使瓊脂培養(yǎng)基表面完全暴露在空氣中 將另一個標有 空氣2 的平板放在已滅菌的無菌操作箱 室 內(nèi) 打開皿蓋 1h后蓋上兩個皿蓋 取出滅菌濕棉簽 在實驗臺面擦拭約2cm2的范圍 然后將棉簽從平板的開啟出伸進平板表面 在E區(qū)滾動一下 立即閉合皿蓋 放回棉簽 用同樣的方法將擦拭了門旋鈕的棉簽在F區(qū)進行滾動接種 將沾有灰塵的棉簽在G區(qū)接種 將滅菌棉簽在H區(qū)接種 實驗步驟 4 培養(yǎng)將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn) 使皿底朝上 置37 培養(yǎng)1 2d 實驗步驟 三 接種 一 用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種1 用記號筆分別標記3支肉湯營養(yǎng)瓊脂斜面為A 接菌 B 接無菌水 C 非無菌操作 和3支液體培養(yǎng)基為D 接菌 E 接無菌水 和F 不接種 2 左手持大腸桿菌斜面培養(yǎng)物 右手持接種環(huán) 將接種環(huán)進行火焰灼燒滅菌 燒至發(fā)紅 然后在火焰旁打開斜面培養(yǎng)物的試管帽 管帽不能放在桌上 并將管口在火焰上燒一下 實驗步驟 3 在火焰旁 將接種環(huán)輕輕插入斜面培養(yǎng)物試管的上半部 此時不要接觸斜面培養(yǎng)物 至少冷卻5s后 挑取少許培養(yǎng)物 菌苔 后 再燒一下管口 蓋上管帽并將其放回試管架中 實驗步驟 4 用左手迅速從試管架上取出A管 在火焰旁取下管帽 管口在火焰上燒一下 將沾有少量菌苔的接種環(huán)迅速放進A管斜面的底部 接種環(huán)不要碰到試管口邊 并從下至上劃一直線 然后再從其底部開始向上作蛇形劃線接種 完畢后 同樣燒一下管口 蓋上管帽 將接種環(huán)在火焰上灼燒后放回原處 如果是向盛有液體培養(yǎng)基的試管和三角燒瓶中接種 則應(yīng)將挑有菌苔的接種環(huán)首先在液體表面的管內(nèi)壁上輕輕摩擦 使菌體分散從環(huán)上脫開 進入液體培養(yǎng)基中 實驗步驟 5 按上述方法從盛有無菌水的試管中取一環(huán)無菌水于B管中 同樣劃線接種 6 以非無菌操作為對照 在無酒精燈或煤氣燈的條件下 用未經(jīng)滅菌的接種環(huán)從另一盛有無菌水的試管中取一環(huán)水劃線接種到C管中 上述無菌操作技術(shù)也可將待接和被接的2支試管同時拿在左手上進行 實驗步驟 二 用吸管轉(zhuǎn)接菌液1 輕輕搖動盛菌液的試管 不要濺到管口或管帽上 暫放回試管架上 2 從已滅菌的吸管筒中取出一支吸管 將其插入吸氣器下端 然后按無菌操作要求 將吸管插入已搖勻的菌液中 吸取0 5ml菌液并迅速轉(zhuǎn)移至D管中 3 取下吸氣器 將用過的吸管放入廢物筒中 筒底必須墊有泡沫塑料等軟墊 以防吸管嘴破損 4 換另一支無菌吸管 按上述同樣方法從盛無菌水的試管中吸取吸取0 5ml菌液轉(zhuǎn)移至E管中 在使用吸管操作過程中 手指不要接觸其下端 實驗步驟 五 細菌制片及簡單染色1 涂片取一塊載玻片 用記號筆平均分為兩個區(qū)域并標記 各滴一小滴生理鹽水于兩個區(qū)域中央 用接種環(huán)無菌操作分別由枯草芽孢桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面和金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面挑取適量菌苔 將沾有菌苔的接種環(huán)置于載玻片的生理鹽水中涂抹 使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜 若用液體培養(yǎng)基涂片 可用接種環(huán)蘸取1 2環(huán)菌液直接涂于載玻片上 實驗步驟 2 干燥自然干燥或用電吹風干燥 3 固定涂菌面朝上 通過火焰2 3次 4 染色將載玻片平放于載玻片支架上 滴加染液覆蓋涂菌部位即可 呂氏堿性美籃1 5min 草酸銨結(jié)晶紫染液或齊氏石炭酸復紅染液1min 5 水洗傾去染液 自來水沖洗 水流不宜過急 過大 勿直接沖涂片處 至洗出無色水為止 實驗步驟 6 干燥用吸水紙吸去多余水分 自然干燥或用電吹風干燥 7 鏡檢將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察 記錄 實驗結(jié)果 注意事項 1 要嚴格按配方配制 2 調(diào)pH不要過頭 3 高壓滅菌要注意物品不要過多 加熱后排除冷空氣 到時降壓回零取物 4 無菌操作需要在火焰旁進行 因此 在操作時要小心 不要將手燙傷 5 禁止用嘴吸取菌液6 用接種環(huán)將菌體與染液混合時不要劇烈涂抹 以免破壞細胞 7 滴加染液要適中 否則用蓋玻片覆蓋時 染液過多會溢出 過少會產(chǎn)生大量氣泡 8 蓋玻片要緩慢傾斜覆蓋 以免產(chǎn)生氣泡 思考 因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓 所以 當水蒸汽中含有空氣時 在同一壓力下 含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度 如果壓力未降到0時 打開排氣閥 就會因鍋內(nèi)壓力突然下降 使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口 造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染 1 高壓蒸汽滅菌開始之前為什么要將鍋內(nèi)的冷空氣排盡 思考 首先要記住 沒有一種條件或培養(yǎng)基能使所有的微生物生長 本實驗中所用的培養(yǎng)基是一種豐富培養(yǎng)基 可以支持大量不同的微生物生長 因此可以滿足本實驗的要求 2 為什么用肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 思考 答 防止菌種污染環(huán)境 違背無菌操作技術(shù)原則 3 為什么接種完畢后 接種環(huán)還必須灼燒后再放回原處 吸管也必須放進廢物筒中 思考 答 1 產(chǎn)生的高溫可以消滅細胞 避免細胞交叉污染2 火焰的溫度能夠使氣流形成負壓 在酒精燈周圍10cm處形成一個無菌區(qū) 4 為什么酒精燈外焰可以形成無菌區(qū)域 小結(jié) 1 獲得試驗成功的關(guān)鍵 牢固樹立無菌概念 細心 認真體會無菌操作的要領(lǐng) 2 了解掌握不同菌落形態(tài) 細菌 細菌是原核微生物 故形成的菌落也小 細菌個體之間充滿著水分 所以整個菌落顯得濕潤 易被接種環(huán)挑起 球菌形成隆起的菌落 有鞭毛細菌常形成邊緣不規(guī)則的菌落 具有莢膜的菌落表面較透明 邊緣光滑整齊 有芽孢的菌落表面干燥皺褶 有些能產(chǎn)生色素的細菌菌落還顯出鮮艷的顏色 較難挑起 霉菌 常呈絨毛狀 絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀 有時還能呈紅 褐 綠 黑 黃等不同顏色 酵母菌 大多數(shù)酵母菌的菌落特征與細菌相似 但比細菌菌落大而厚 菌落表面光滑 濕潤 粘稠 容易挑起 菌落質(zhì)地均勻 正反面和邊緣 中央部位的顏色都很均一 菌落多為乳白色 少數(shù)為紅色 個別為黑色 大腸桿菌 在普通瓊脂培養(yǎng)基上面都是一樣的 圓形邊緣整齊 表面光滑 半透明 小凸起 典型的大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板上的特征為 深紫黑色 光滑 濕潤 帶有金屬光澤的圓形菌落 鏡檢為革蘭氏陰性 紅色 無芽孢桿菌 金黃色葡萄球菌 在BP培養(yǎng)基上 圓形 光滑 凸起濕潤 顏色呈黑灰色 邊緣整齊 周邊渾濁 外層有一透明帶 在血平板上 圓形 金黃色 凸起 表面光滑 有溶血圈 鏡檢為革蘭氏陽性 呈葡萄狀排列 謝謝 THANKS