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《生物技術制藥》復習資料 （Biotechnological Pharmaceutics） 第一章 緒論 一、概述 1.概念：生物藥物（生物制藥）是泛指包括生物制品在內(nèi)的生物體的初級和次級代謝產(chǎn)物或生物體的某一組成部分，甚至整個生物體用作診斷和治療疾病的醫(yī)藥品。|采用現(xiàn)代生物技術人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品，叫做生物技術制藥。 2.技術范疇：基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程以及后來衍生出來的第二代、第三代的蛋白質工程、抗體工程、糖鏈工程和海洋生物技術等。 3.相關學科：有生物學（含微生物學、分子生物學、遺傳學等）、化學、工程學（化學工程、電子工程等）、醫(yī)學、藥學、農(nóng)學等。但從基礎學科來講，生物學、化學和工程學是其主要的學科。 4.應用范圍：（1）醫(yī)藥；（2）農(nóng)業(yè)；（3）食品；（4）工業(yè)；（5）環(huán)境凈化；（6）能源。 二、生物技術的發(fā)展簡史 1.傳統(tǒng)生物技術階段 主要產(chǎn)品：乳酸、酒精、丙酮、丁酸、檸檬酸、淀粉酶。 生產(chǎn)的特點：過程簡單，大多屬兼氣發(fā)酵或表面培養(yǎng)，生產(chǎn)設備要求不高，產(chǎn)品化學結構簡單，屬初級代謝產(chǎn)物。 2.近代生物技術階段 主要產(chǎn)品：抗生素、維生素、甾體、氨基酸；食品工業(yè)的工業(yè)酶制劑、食用氨基酸、酵母、啤酒；化工業(yè)的酒精、丙酮、丁醇、沼氣；農(nóng)林業(yè)的農(nóng)藥；環(huán)境保護業(yè)的生物治理污染。 生物技術的特點：（1）產(chǎn)品類型多，初級（氨基酸、酶、有機酸）、次級（抗生素）、生物轉化（甾體）；（2）生物技術要求高，純種、無菌、通氣，產(chǎn)品質量要求也高；（3）生產(chǎn)設備規(guī)模大；（4）技術發(fā)展速度快。 3.現(xiàn)代生物技術 主要產(chǎn)品：胰島素、干擾素、生長激素等。 生物技術的內(nèi)容包括：（1）重組DNA技術及其它轉基因技術（基因工程）；（2）細胞和原生質體融合技術（細胞工程）；（3）酶或細胞的固定化技術（酶工程）；（4）植物脫毒和快速繁殖技術；（5）動物細胞大量培養(yǎng)技術；（6）動物胚胎工程技術；（7）現(xiàn)代發(fā)酵技術；（8）現(xiàn)代生物反應工程和分離工程技術；（9）蛋白質工程技術；（10）海洋生物技術。 三、醫(yī)藥生物技術的新進展 1.基礎研究不斷深入 2.新產(chǎn)品不斷出現(xiàn) 3.新試劑、新技術不斷出現(xiàn) 4.新型生物反應器和新分離技術不斷出現(xiàn) 四、我國的醫(yī)藥生物技術 五、醫(yī)藥生物技術的新進展 1.利用新發(fā)現(xiàn)的人類基因，開發(fā)新型藥劑。 2.新型疫苗的研制。 3.基因工程活性肽。 4.其他。如疾病早期診斷，PCR，單克隆抗體。 第二章 生物藥物概論 第一節(jié) 生物藥物的來源、特性、分類與制備 一、生物藥物的來源 1.生物藥物是指運用生物學、醫(yī)學、生物化學等的研究成果，從生物體、生物組織、細胞、體液等，綜合利用物理學、化學、生物化學、生物技術和藥學等學科的原理和方法制造的一類用于預防、治療和診斷的制品。 2.生物藥物的原料來源 天然的生物材料：人體、動植物、微生物和各種海洋生物。 人工制得的生物原料如基因工程技術制得的微生物或細胞。 二、生物藥物的特性 1.藥理學特性（優(yōu)點） （1）治療的針對性強。細胞色素C用于治療組織缺氧所引起的一系列疾病；（2）藥理活性高。注射用的純ATP可以直接供給機體能量；（3）毒副作用小，營養(yǎng)價值高。蛋白質、核酸、糖類、脂類等生物藥物本身就直接取自體內(nèi)；（4）生理副作用常有發(fā)生。生物體之間的種屬差異及個體差異，用藥時會發(fā)生免疫反應和過敏反應。 2.生產(chǎn)、設備中的特殊性 （1）原料中的有效物含量低。激素、酶在體內(nèi)含量極低；（2）穩(wěn)定性差。生物藥物的分子結構中具有特定的活性部位，該部位有嚴格的空間結構，一旦結構破壞，生物活性也就隨著消失；（3）易腐敗。生物藥物營養(yǎng)價值高，易染菌、腐敗。生產(chǎn)過程中應低溫、無菌；（4）注射用藥有特殊要求。均一性、安全性、穩(wěn)定性、有效性。 3.檢驗上的特殊性 由于生物藥物具有生理功能，故生物藥物不僅要有理化檢驗指標，更要有生理活性檢驗指標。 三、生物藥物的分類 1.（生物制藥的研究內(nèi)容）按生物工程學科范圍分為四類分類： （1）發(fā)酵工程制藥；（2）基因工程制藥：（3）細胞工程制藥；（4）酶工程制藥。 2.按藥物的結構分類： （1）氨基酸及其衍生物類藥物；（2）多肽和蛋白質類藥物；（3）酶和輔酶類藥物；（4）核酸及其降解物和衍生物類藥物；（5）糖類藥物；（6）脂類藥物；（7）細胞生長因子；（8）生物制品類。 3.按來源分類： （1）人體組織來源。療效好、無副作用、來源有限。（2）動物組織來源。動物臟器，來源豐富、價格低廉、可以批量生產(chǎn)。（3）植物組織來源。中草藥，酶、蛋白質、核酸。（4）微生物來源?？股亍被?、維生素、酶。（5）海洋生物來源。動植物、微生物。 4.按生理功能和用途分類： （1）治療藥物。腫瘤、艾滋病、心腦血管疾病等。（2）預防藥物。傳染性強的疾病，疫苗、菌苗、類毒素。（3）診斷藥物。速度快、靈敏度高、特異性強。免疫診斷、酶診斷、基因診斷試劑。（4）其它。生化試劑、保健品、化妝品、食品、醫(yī)用材料。 四、生物藥物的制備過程 1.生物藥物原料的選擇、預處理與保存方法 （1）原料選擇原則 有效成分含量高，原料新鮮，來源豐富、易得，產(chǎn)地較近，原料中雜質含量少，成本低。 （原料 → 粗提 → 精提） 生物技術 單元操作 （2）預處理與保存 預處理：就地采集后去除結締組織、脂肪組織等不用的成分，將有用成分保鮮處理，收集微生物原料時，要及時將菌體與培養(yǎng)液分開，進行保鮮處理。 保存方法：①冷凍法，適用于所有生物材料，-40℃；②有機溶劑脫水法，丙酮，適用于原料少、價值高，有機溶劑對原料生物活性無影響；③防腐劑保鮮，常用乙醇、苯酚等，適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液。 第二節(jié) 人體來源的藥物 一、人體來源藥物的特點與研究意義 1.人體來源的藥物的特點 （1）安全性好。不易產(chǎn)生副反應。（2）效價高、療效可靠。質量好、效價高。（3）穩(wěn)定性好。凍干制劑10度以下可保存2年以上。 3.研究意義 （1）資源的有限性；（2）意義。 3.蛋白質類藥物分離提取方法 （1）沉淀法（鹽析、有機溶劑、等電點）；（2）按分子大小分離（超濾、透析、層析、離心）；（3）電荷（離子交換、層析、電泳、等電聚焦）；（4）親和層析法（酶與底物、抗原與抗體）。 二、人體來源藥物的種類和用途 1.人血液成分制品 （1）紅細胞制劑；（2）白細胞濃縮液；（3）血小板制劑；（4）新鮮冰凍血漿（FFP）。 2.血漿的綜合利用 （1）傳輸?shù)鞍踪|；（2）免疫球蛋白；（3）凝血系統(tǒng)蛋白；（4）補體系統(tǒng)蛋白；（5）蛋白酶抑制物類。 3.人體液細胞中的活性物質 體液細胞包括紅細胞、白細胞、淋巴細胞、血小板、成纖維細胞等?；钚晕镔|主要是干擾素α、白介素-2、超氧化物歧化酶等。 4.人類來源的其他原料的利用 5.細胞因子 6.人體激素 激素是調節(jié)機體正常發(fā)育和活動的重要物質，是由一類動物體內(nèi)腺體細胞和非腺體組織細胞所分泌的化學信息分子。激素主要有：蛋白質激素、多肽激素、氨基酸衍生物激素、脂類激素。激素在體內(nèi)含量很低，研究目的不是用生物體來提取，而是用于指導用其他原料進行生產(chǎn)和如何正確使用激素藥物進行治療?，F(xiàn)在的生產(chǎn)方法有：用動物提取，半合成法，基因工程法。 第三節(jié) 動物來源的藥物 三、動物來源藥物的種類與用途 1.動物多肽與蛋白質類藥物 （1）動物多肽藥物的重要性與種類 重要性：腦垂體所分泌的多肽激素，藥效顯著，且毒副作用小，通過對這些活性物質的結構和功能的研究，有助于我們設計和研制新型藥物。 （2）動物蛋白類藥物 2.動物酶與輔酶類藥物 種類：促消化酶類（胃酶可口服，蛋白酶，胰酶）；消炎酶類（溶菌酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等可提高毛細血管通透性，消退浮腫）；治療心血管疾病（纖溶酶、尿激酶、凝血酶）；抗腫瘤的酶（天冬氨酰酶、谷氨酰胺酶、半胱氨酸酶、組氨酸酶）。 3.動物核酸類藥物 4.動物糖類藥物 5.動物脂類藥物：脂肪酸及其衍生物、磷脂類、膽酸類、卟啉和衍生物。 第四節(jié) 植物來源的藥物 一、糖類——單糖、多糖、寡糖。 二、脂類、類脂、固醇及其衍生物 三、蛋白質、多肽及其活性物質 四、化合物——特別小分子化合物及其衍生物。是近幾年來研究最為活躍的領域。 實例：超氧化物歧化酶的制備、精油、南瓜多糖等。 第五節(jié) 海洋生物藥物 一、取得重要進展的領域 （1）海洋生物抗癌活性物質；（2）海洋生物抗菌活性物質；（3）海洋生物抗心血管疾病活性物質；（4）海洋生物抗放射性活性物質及酶類；（5）海洋前列腺素；（6）海洋保健品、螺旋藻；（7）海洋醫(yī)用生物材料。鱟試劑、河豚毒素試劑、甲殼素、珊瑚。 二、我國發(fā)展海洋藥物的主攻方向 1.海洋生物活性物質的研究 2.大力促進海洋生物技術在開發(fā)海洋藥物上的應用 3.開發(fā)新的海洋中成藥和新劑型 4.充分利用海洋資源，開發(fā)海洋保健品 5.開發(fā)新的海洋醫(yī)用生物材料 第三章 生物技術制藥單元操作與藥物生產(chǎn)的質量控制 第一節(jié) 生物技術制藥單元操作 一、概述 生物藥物的提取和純化可分為5個主要步驟：預處理、固液分離、濃縮、純化和產(chǎn)品定型（干燥，制丸，擠壓，造粒，制片），每一步驟都可采用各種單元操作。 在提取純化過程中，要盡可能減少操作步驟，因為每一操作步驟都不可避免帶來損失。操作步驟多，總收率就會下降。 二、提取純化的工藝論證 工藝驗證，就是通過系統(tǒng)的方法得到關于生產(chǎn)工藝的書面材料，證明并保證生產(chǎn)過程能始終如一地生產(chǎn)出特定的高質量的產(chǎn)品。 工藝驗證的范圍：廠房設施、工程儀表、機械設施、生產(chǎn)環(huán)境、工藝條件、計算機軟件、介質、原材料、半成品、成品、操作人員素質和測試方法等。以上各個部分都要有驗證材料或試驗數(shù)據(jù)，根據(jù)這些材料和數(shù)據(jù)寫出驗證報告。 當工藝的某一部分有較大變動時（如大修、工藝條件變化），要進行重新驗證，即再驗證。再驗證是針對某一部分的行動，而不是整個工藝過程的驗證，因而比較簡單、快速、易行。 驗證的實施過程包括以下步驟：提出驗證要求，組織驗證小組，制定驗證方案，實施驗證試驗，寫出驗證報告，再驗證等。 三、原料選擇、預處理與固液分離技術 （一）原料選擇的基本準則 1.在大量的信息資料和實踐經(jīng)驗的基礎上，選擇目標原料； 2.選擇有效成分含量高的新鮮材料； 3.來源豐富易得； 4.制造工藝簡單易行； 5.成本比較低； 6.原料的采集不破壞生態(tài)環(huán)境，選擇對環(huán)境友好的原材料資源，防止生物入侵。 （二）細胞破碎 機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法、X-press法等。 非機械法：酶溶法、化學滲透法、凍融法、干燥法等。 （三）離心 1.差速離心法 2.速率區(qū)帶離心法 速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。 （四）膜分離法 1.薄膜分離 （1）超濾：根據(jù)溶質分子和懸浮粒子是否通過多孔膜來進行篩分。 （2）反滲透：以高分子透過性薄膜為分離介質，在超過溶液滲透壓力的情況下，使溶液中的溶劑透過薄膜，同時使溶質和不溶物阻截在膜前。 （3）微孔濾膜：由高分子材料制成的薄膜過濾介質，可以過濾一般介質不能截留的細菌和微粒。膜的孔徑在0.2～10μm。 （4）滲析：它是利用多孔膜兩側溶液的濃度差使溶質從濃度高的一側通過膜孔擴散到濃度低的一側從而得到分離的過程。 （5）電滲析：電滲析是基于離子交換膜能選擇性的使陰離子或陽離子通過的性質，在直流電場的作用下使陰陽離子分別透過相應的膜以達到從溶液中分離電解質的目的。 2.膜分離設備 （1）板框式膜組件；（2）卷式膜組件；（3）管式膜組件；（4）中空纖維膜組件。 四、沉淀法 1.鹽析法 利用不同的蛋白質在高濃度鹽溶液中，溶解度不同程度的降低來進行分離純化。在低鹽濃度下，溶解度隨著鹽濃度升高而增加，稱鹽溶作用；當鹽濃度不斷升高時，不同蛋白質的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，稱鹽析作用。 優(yōu)點：設備和條件要求低，安全應用范圍廣泛。在高鹽情況下，蛋白質不易發(fā)生變化，一般在室溫下操作。 缺點：分級分離能力不高。 鹽析時應注意的幾個問題： （1）鹽飽和度：由于蛋白質的結構和性質不同，鹽析要求的飽和度也不同。要按工藝要求，正確計算飽和度。 （2）pH值的選擇：蛋白質在pI時的溶解度最小。因此，進行鹽析時的pH，要選擇在被分離蛋白質的pI附近。 （3）蛋白質濃度（蛋白質的溶解度）：在相同條件下，蛋白質濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度極限也愈低。蛋白質濃度愈高，其他蛋白質共沉作用也愈強，這是不希望的。選擇適當?shù)牡鞍踪|濃度，可避免共沉的干擾。 （4）溫度：一般在室溫下進行，濃鹽對蛋白質有保護作用。但對溫度敏感的，要在低溫下進行。常在0-4℃范圍內(nèi)迅速操作。如尿激酶。 （5）鹽析沉淀物的脫鹽：鹽析的沉淀分離后，經(jīng)脫鹽才能獲得純品。最常用的脫鹽方法是透析，時間一般較長，應常換透析液，注意防止污染。 2.有機溶劑沉淀法 利用不同蛋白質在不同濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離目的蛋白質的方法。蛋白質的沉淀與溶解，與溶劑的介電常數(shù)有關。降低溶液的介電常數(shù)，使其溶解度變小，同時，還破壞蛋白質的水化膜而使蛋白質沉淀析出。 有機沉淀法應注意的問題： （1）控制工藝過程的溫度：整個操作規(guī)程應在低溫下進行，而且最好是同一溫度。 （2）防止溶劑局部溫度過高：加入有機溶劑時攪拌要均勻，速度要適當，避免局部濃度過高，引起沉淀物的破壞、變性或失活。 （3）及時處理沉淀物：沉淀物經(jīng)過濾或離心后，要立即用水或緩沖液溶解，降低有機溶劑的濃度。 （4）pH的選擇：在待沉淀蛋白質的pI附近（，蛋白質在pI時的溶解度最小）。 （5）有機溶劑是酶和蛋白質的變性因素，尤其是對敏感酶類。 3.等電點沉淀法 利用蛋白質在等電點時的溶解度最低，而各種蛋白質又具有不同的等電點的特性進行分離的工藝過程。 4.水溶性非離子型聚合物沉淀法 在一定的pH值下，鹽濃度越高，所需PEG時濃度越低，溶液的pH越接近目的物的等電點，沉淀所需PEG的濃度越低。 五、萃取 （一）雙水相萃取 雙水相體系的形成是兩種天然或合成的親水性聚合物水溶液相互混合，由于較強的斥力或空間位阻，相互之間無法滲透，在一定條件下，即可形成雙水相體系。 雙水相萃取的技術特征： （1）體系有生物親和性。（2）體系能進行萃取性的生物轉化。（3）體系能與細胞相結合，操作既節(jié)省萃取設備和時間，又避免了胞內(nèi)酶的損失。（4）親和萃取可大大提高分配系數(shù)和萃取專一性。（5）任何兩相體系，都不要求特殊的處理就可與后續(xù)純化工藝相銜接。（6）開發(fā)廉價新型的雙水相體系。 （二）超臨界流體萃取 1.技術原理 在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小的成分依次萃取出來。 2.萃取裝置 超臨界萃取裝置從功能上大體可分為八部分：萃取劑供應系統(tǒng)、低溫系統(tǒng)、高壓系統(tǒng)、萃取系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、改性劑供應系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和計算機控制系統(tǒng)。 3.超臨界流體萃?。⊿FE）的特點（優(yōu)點） （1）可以在接近室溫（35-40℃）及CO2氣體籠罩下進行提取，有效地防止了熱敏性物質的氧化和逸散。 （2）使用SFE是最干凈的提取方法，由于全過程不用有機溶劑，因此萃取物絕無殘留溶媒，同時也防止了提取過程對人體的毒害和對環(huán)境的污染，是100%的純天然（產(chǎn)物中無雜質）； （3）萃取和分離合二為一，當包含溶解物的CO2-SCF流經(jīng)分離器時，由于壓力下降使得CO2與萃取物迅速成為兩相（氣液分離）而立即分開，不僅萃取效率高而且能耗較少，節(jié)約成本（SCF立方英尺）； （4）CO2是一種不活潑的氣體，萃取過程不發(fā)生化學反應，且屬于不燃性氣體，無味、無臭、無毒，故安全性好； （5）CO2價格便宜，純度高，容易取得，且在生產(chǎn)過程中（可）循環(huán)使用，從而降低成本； （6）壓力和溫度都可以成為調節(jié)萃取過程的參數(shù)。通過改變溫度或壓力達到萃取目的。 六、層析法 1.離子交換層析。2.凝膠層析。3.親和層析。 七、電泳技術 （一）醋酸纖維素薄膜電泳。（二）瓊脂糖凝膠電泳。 （三）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。（四）等電聚焦電泳技術。 八、其它技術 （一）濃縮是指低濃度溶液通過除去溶劑變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^程。常在提取后和結晶前進行，有時也貫穿于整個制藥過程。 （二）結晶是利用某些藥物具有形成晶體的性質是目標藥物（溶質）呈晶態(tài)從溶液中析出的過程。 （三）干燥是從濕的固體生物藥物中，除去水分或溶劑而獲得相對或絕對干燥制品的工藝過程。它也是一種蒸發(fā)，但不同于濃縮。通常包括原料藥的干燥和制成臨床制劑的干燥。 （1）常壓干燥。通風與加熱結合。成本低，干燥量大。但時間長，易污染。 （2）減壓干燥。利用專用設備減壓加速，使溶劑迅速蒸發(fā)。時間短，溫度低。制藥常用方法。 （3）噴霧干燥。將液體通過噴射裝置噴成霧滴后，在一定流速的熱氣流中，迅速蒸發(fā)干燥的方法。 第二節(jié) 生物技術藥物生產(chǎn)的質量控制 什么是藥品的六個“P”？ 1.什么是GAP？ GAP：英文名稱“Good Agricultural Practice”的縮寫。直譯為“良好的農(nóng)業(yè)規(guī)范（因為中藥材栽培或飼養(yǎng)主要屬于農(nóng)業(yè)范疇）”，在中藥行業(yè)譯為“中藥材生產(chǎn)質量管理規(guī)范”。 2.什么是GCP？ GCP：英文名稱“Good Clinical Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品臨床試驗管理規(guī)范”， 是規(guī)范藥品臨床試驗全過程的標準規(guī)定，其目的在于保證臨床試驗過程的規(guī)范，結果科學可靠，保護受試者的權益并保障其安全。 3.什么是GLP？ GLP：英文名稱“Good Laboratory Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品實驗室管理規(guī)范”。目前，在我國是指于 2003年9月1日起施行《藥物非臨床研究質量管理規(guī)范》（局令第2號）。 4.什么是GSP？ GSP：英文名稱“Good Supply Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品經(jīng)營質量管理規(guī)范”，它 是控制醫(yī)藥商品流通環(huán)節(jié)所有可能發(fā)生質量事故的因素從而防止質量事故發(fā)生的一整套管理程序。 5.什么是GUP？ GUP：英文名稱“Good Use Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品使用質量管理規(guī)范”，在我國是指 《醫(yī)療機構藥劑質量管理規(guī)范》。 6.什么是GMP？ GMP：英文名稱“Good Manufacturing Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范”，在我國，GMP是指 國家藥品監(jiān)督管理局于1999年3月18日通過，6月18日發(fā)布，8月1日起開始正式實施的《藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范》（局令9號）。這個規(guī)范是藥品生產(chǎn)和質量管理的基本準則，適用于藥品制劑生產(chǎn)的全過程和原料生產(chǎn)中影響成品質量的關鍵工序。它是一種強制性認證，沒有通過認證的生產(chǎn)企業(yè)或生產(chǎn)車間已于2004年7月1日實行強制性停產(chǎn)。 第四章 基因工程制藥 第一節(jié) 概述 問題：基因工程菌生產(chǎn)藥物的優(yōu)點？ 第二節(jié) 基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程 主要程序是：目的基因的克隆，構建DNA重組體，將DNA重組體轉入宿主菌構建工程菌，工程菌的發(fā)酵，外源基因表達產(chǎn)物的分離純化，產(chǎn)品的檢驗等。 基因工程藥物的生產(chǎn)是一項十分復雜的系統(tǒng)工程，可分為上游和下游兩個階段。上游階段是研究開發(fā)必不可少的基礎，它主要是分離目的基因、構建工程菌（細胞）。下游階段是從工程菌（細胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質量控制等。 第三節(jié) 基因工程藥物的分離純化 基因工程藥物具有下列特點：（1）目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低；（2）含目的產(chǎn)物的初始物料組成復雜；（3）目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質對pH、溫度、金屬離子、有機溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易失活、變性；（4）種類繁多，包括有大、中、小分子、結構簡單或復雜的有機化合物，以及結構復雜及性質各異的生物活性物質；（5）應用面廣，對其質量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱原等。 一、建立分離純化工藝的依據(jù) 1.含目的產(chǎn)物的起始物料的特點： （1）菌種類型及其代謝特征。（2）原材料和培養(yǎng)基的來源及其質量。（3）生產(chǎn)工藝和條件。包括滅菌方法和條件、生產(chǎn)方式、生產(chǎn)周期、生產(chǎn)能力、工藝控制條件、因素及方式等。（4）初始物料的物理、化學和生物學特性。 2.物料中雜質的種類和性質 3.目的產(chǎn)物特性 4.產(chǎn)品質量的要求 二、分離純化的基本過程 基因工程藥物分離純化一般不應超過4-5個步驟，包括細胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。 三、分離純化的技術 1.細胞破碎與固液分離。2.目的產(chǎn)物的分離純化。3.非蛋白質類雜質的去除。 分離純化技術應滿足下列要求：（1）技術條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；（2）選擇性要好，能從復雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來，達到較高純化倍數(shù)；（3）收率要高；（4）兩個技術之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調整，這樣可以減少工藝步驟；（5）整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。 四、選擇分離純化方法的依據(jù) 1.根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇 2.根據(jù)分離單元之間的銜接來選擇 通常先運用非特異、低分辨的操作單元，以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要的雜質；隨后采用高分辨率的操作單元：凝膠排阻色譜這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后。 3.根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇 分離純化工藝應遵循以下原則： （1）具有良好的穩(wěn)定性和重復性（能產(chǎn)業(yè)化）。 （2）盡可能減少組成工藝的步驟。 （3）組成工藝的各技術或步驟之間要能相互適應和協(xié)調，工藝與設備也能相互適應，從而減少步驟之間對物料的處理和條件調整。 （4）在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產(chǎn)品質量。 （5）分離純化工藝所用的時間要盡可能短，因穩(wěn)定性差的產(chǎn)物隨工藝時間增加收率。 （6）工藝和技術必須高效，收率高，易操作，對設備條件要求低，能耗低。 （7）具有較高的安全性。在選擇后處理技術、工藝和操作條件時，要能確保去除有危險的雜質，保證產(chǎn)品質量和使用安全，以及生產(chǎn)過程的安全。 第四節(jié) 基因工程藥物的質量控制 一、原材料的質量控制 二、培養(yǎng)過程的質量控制 三、純化工藝過程的質量控制（產(chǎn)品有足夠的生理和生物學試驗數(shù)據(jù)資料，確證提純物分子批間保持一致性。外源蛋白質，DNA與熱原質都控制在規(guī)定限度以下） 四、目標產(chǎn)品的質量控制 質量控制主要要求：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。 1.產(chǎn)品的鑒別。2.純度分析。3.生物活性測定。4.穩(wěn)定性考察。5.產(chǎn)品一致性的保證。（6.安全性） 五、產(chǎn)品的保存 1.液態(tài)保存 （1）低溫保存；（2）在穩(wěn)定pH條件下保存；（3）高濃度保存；（4）加保護劑保存。 2.固態(tài)保存 固態(tài)蛋白質比液態(tài)穩(wěn)定，一般蛋白質含水量超過10%時容易失活。含水量降到5%時，在室溫或冰箱中保存比較穩(wěn)定。凍干粉或結晶都具有強抗熱性和穩(wěn)定性。 第五章 細胞工程制藥 第一節(jié) 概述 細胞工程可分為動物細胞工程和植物細胞工程。 動物細胞工程包括：細胞培養(yǎng)技術；細胞融合技術；胚胎工程技術；克隆技術。 植物細胞工程包括：植物組織、器官培養(yǎng)技術；細胞培養(yǎng)技術；原生質體融合與培養(yǎng)技術；亞細胞水平的操作技術等。 第二節(jié) 動物細胞工程制藥 1.細胞融合。單克隆抗體。 2.核移植就是將一個動物的細胞核，移植到卵細胞中，并發(fā)育成長。 3.轉基因動物是指經(jīng)人的有意干涉，通過實驗手段將外源基因導入動物細胞中并穩(wěn)定地整合到動物基因組中，且能遺傳給子代的動物。 4.動物細胞培養(yǎng)。是指離散的動物活細胞在體外人工條件下的生長、增殖的過程。 第三節(jié) 植物細胞工程制藥 1.組織及細胞培養(yǎng)。2.遺傳特性改造。3.轉基因植物。 轉基因植物生產(chǎn)重組蛋白具有以下優(yōu)點：1.與動物細胞培養(yǎng)相比，植物細胞培養(yǎng)條件簡單且易于成活，有利于遺傳操作；2.植物培養(yǎng)細胞具有全能性，能夠再生植株；3.轉基因植物中的外源基因可通過植物雜交的方法進行基因重組，進而在植物體內(nèi)積累多基因；4.轉化植株系的種子易于貯存，有利于重組蛋白的生產(chǎn)和運輸；5.用動物細胞生產(chǎn)重組蛋白，可能污染動物病毒，這對人類可能造成潛在危險，而植物病毒不感染人類，所以用植物細胞生產(chǎn)重組蛋白更為安全；6.植物細胞有與動物細胞相似的結構和功能，有利于重組蛋白的正確裝配和表達。 第四節(jié) 細胞工程制藥未來發(fā)展前景 1.人源化抗體的研制和生產(chǎn) 注入人體后會產(chǎn)生抗體（抗抗體）或激發(fā)免疫反應。 2.啟動“分子藥田”工程 3.實施“動物藥廠”計劃 第六章 酶工程制藥 第一節(jié) 概述 酶工程（Enzyme Engineering）是酶學和工程學相互滲透結合、發(fā)展而形成的一門新的技術學科。 酶工程的主要內(nèi)容：酶的生產(chǎn)、分離純化、酶的固定化、酶及固定化的反應器、酶和固定化酶的應用。 現(xiàn)代酶工程的主要（研究）內(nèi)容： （1）酶的分離純化（提純）、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應用開發(fā)； （2）酶和細胞的固定化及酶反應器的研究，包括酶傳感器、反應檢測等； （3）酶生產(chǎn)中基因工程技術的應用及遺傳修飾酶（突變酶）的研究； （4）酶的分子改造和化學修飾，（以及酶的）結構與功能（之間關系）的研究； （5）有機相中酶反應的研究； （6）酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)與應用研究； （7）抗體酶、核酸酶的研究； （8）模擬酶、合成酶及酶分子的人工設計、合成研究。 第二節(jié) 藥用酶的生產(chǎn) （藥用酶：可用于預防和治療疾病的酶。） 一、藥用酶的生產(chǎn)方法 （1）提取法；（2）生物合成法；（3）化學合成法。 二、提高藥用酶產(chǎn)量的措施 1.添加誘導物。2.控制阻遏物濃度。3.添加表面活性劑。4.添加刺激劑。5.添加產(chǎn)酶促進劑。 第三節(jié) 藥物的酶法生產(chǎn) 一、酶的選擇與反應條件的優(yōu)化 二、酶的固定化 制備固定化酶的過程稱為酶的固定化，固定化所采用的酶，可以是經(jīng)提取分離后得到的有一定純度的酶，也可以是結合在菌體（死細胞）或細胞碎片上酶或酶系。 酶的一些不足： （1）酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、pH值和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活； （2）酶一般都是在水溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應結束后，即使酶仍有較高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使得成本較高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)； （3）酶反應后成為雜質與產(chǎn)物混在一起，無疑給進一步的分離純化帶來一定的困難。 1.固定化酶的定義 固定化酶，是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經(jīng)物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。 （酶類可粗分為天然酶和修飾酶，固定化酶屬于修飾酶。） 2.固定化酶的特點（優(yōu)點） （1）可以（在較長時間內(nèi)）多次使用，而且在多數(shù)情況下，酶的穩(wěn)定性提高。 （2）反應后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化，產(chǎn)品質量高。 （3）反應條件易于控制，可實現(xiàn)轉化反應的連續(xù)化和自動控制。 （4）酶的利用效率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量減少。 （5）比水溶性酶更適合于多酶反應。 3.酶和細胞的固定化方法 酶和細胞的固定化方法的分類 （1）載體結合法 ①物理吸附法 物理吸附法是用物理方法將酶吸附于不溶性載體上的一種固定化方法。 ②離子結合法 離子結合法是酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不溶性載體上的固定化方法 ③共價結合法 共價結合法是酶以共價鍵結合于載體上的固定化方法 （2）交聯(lián)法（——共價鍵） 交聯(lián)法是用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物的細胞與細胞之間交聯(lián)的固定化方法。 （3）包埋法 ①網(wǎng)格型。將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型。 ②微囊型。將酶或細胞包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。 （4）選擇性熱變性法 4.酶和細胞的固定化過程中使用載體的條件： （1）固定化過程中不引起菌變性； （2）對酸堿有一定的耐受性； （3）有一定的機械強度； （4）有一定的親水性及良好的穩(wěn)定性； （5）有一定的疏松網(wǎng)狀結構，顆粒均勻； （6）共價結合時具有可活化基團； （7）有耐受酶和微生物細胞的能力； （8）廉價易得。 （酶和細胞的固定化載體，主要有以下三類：） （1）吸附載體。吸附法有物理吸附和離子吸附兩種。物理吸附所用的載體有無機物和有機物。 （2）包埋載體。包埋法制備固定化酶或細胞的載體有卡拉膠等。目前，工業(yè)上應用的包埋載體主要為卡拉膠、海藻膠等。 （3）共價結合載體（交聯(lián)載體）。用共價結合法制備固定化酶或細胞所用的載體有纖維素、SephadexA200、瓊脂、瓊脂糖、苯胺多孔玻璃等。 5.固定化酶的制備技術 （1）物理吸附法中蛋白質與載體結合力較弱，而且酶容易從載體上脫落，活力下降，故此法不常用；離子交換吸附法是將解離狀態(tài)的酶溶液與離子交換劑混合后，洗去未吸附的酶和雜質即得固定化酶，本方法中離子交換劉的結合蛋白質能力較強，常彼采用。 影響載體吸附的因素較多，如溶液的pH、離子強度、溫度、蛋白質濃度及載體的比表面積等。 （2）包埋法制備固定化酶技術 包埋法又分為凝膠包埋法和微囊化包埋法兩類。凝膠包埋這是將酶或細胞限制于高聚物網(wǎng)格中的技術；微囊化法是將酶或細胞定位于不同構型的膜外殼內(nèi)的技術。 其基本制備方法有界面沉降法及界面聚合法兩類。 ①界面沉降法。本法是物理法，是利用某些在水相和有機相界面上溶解度極低的高聚物成膜的過程將酶包埋的方法。其基本過程是將酶液在與水不混溶的、沸點比水低的合機相中乳化，使用油溶性表面活性劑形成油包水的微滴，再將溶于有機溶劑的高聚物加入攪拌下的乳化液中，然后再加入另一種不能溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油水界面上沉淀、析出及成膜。最后在乳化劑作用下使微囊從有機相中轉移至水相，即成為固定化酶。用于制備微囊的高聚物材料有硝酸纖維素、聚苯乙烯及聚甲基丙烯酸甲酯等。微囊化的條件溫和，制備過程不致引起酶的變性，但要完全除去半透膜上殘留的有機溶劑卻不容易。 ②界面聚合法。本法是化學制備法，其基本原理是利用不溶于水的高聚物單體在油－水界面上聚合成膜的過程制備微囊。成膜的高聚物有尼龍、聚酰胺及聚脲等。現(xiàn)以尼龍610為例，其基本過程是將含酶的10％血紅蛋白溶液與己甲叉二胺水溶液混合，再傾入含有1％Span85的氯仿-環(huán)己烷中分散乳化，加入溶于有機相的癸二酰氯后，便在油－水界面上發(fā)生聚合反應，棄去上清后，加入Tween20去乳化，洗去有機溶劑及末聚合的單體，將其轉移至水相中即得微囊。 纖維包埋法是將可形成纖維的高聚物溶于與水不混溶的有機溶劑中，再與酶溶液混合并乳化，然后將乳化液經(jīng)噴頭擠入促凝利(如甲苯及石油醚等)中形成纖維，即成為固定化酶。 （3）交聯(lián)法制備固定化酶技術 例如0.2％的木瓜蛋白酶和0.3％的戊二醛在pK5.2～7.2，0℃下，24h即完成反應，反應速度隨溫度的升高而增大。若pH低于4.0，即使長時間反應也不能實現(xiàn)酶的固定化。酶晶體也可以用交聯(lián)法實現(xiàn)固定化，但在交聯(lián)過程中酶容易失活。 （4）共價結合法制備固定化酶的技術 共價結合法制備固定化酶的優(yōu)點是酶與載體結合牢固，穩(wěn)定性好；缺點是載體需要活化，固定化操作復雜，反比條件比較劇烈，酶容易失活和產(chǎn)生空間位阻效應。 6.固定化酶的形狀與性質 6.1 固定化酶的形狀 （1）顆粒狀固定化酶（制備方法簡單，顆粒比表面積大，轉化效率高，適用于各種類型的反應器）；（2）纖維狀固定化酶（比表面積大，轉化效率高，但只適用于填充床反應器）；（3）膜狀固定化酶/酶膜（表面積大，滲透阻力小，可用于酶電極，破碎后也可用于填充床反應器）；（4）管狀固定化酶/酶管（機械強度大，切短后可用于填充床反應器，也可以組裝成列管式反應器）。 6.2 固定化酶的性質 （1）酶活力的變化 （2）酶穩(wěn)定性的變化 穩(wěn)定性包括：①操作穩(wěn)定性。②貯藏穩(wěn)定性。③熱穩(wěn)定性。④對蛋白酶的穩(wěn)定性。 （3）酶學特性的變化。①底物專一性。②最適pH。③最適溫度。④米氏常數(shù)（Km）。⑤最大反應速度（Vmax）。 7.固定化酶活力的測定方法 三、酶的非水相催化 其催化活性與水溶液中相當，甚至更高，并且具有下列顯著特點： （1）提高非極性底物和產(chǎn)物的溶解度，從而提高反應速度。 （2）可催化水解反應的逆反應，而合成（酶類、）多肽、酯類等化合物。 （3）有利于反應后酶與產(chǎn)物的分離。 （4）解除或減少某些產(chǎn)物對酶的抑制作用。 （5）提高酶的穩(wěn)定性。 第七章 發(fā)酵工程制藥 一、發(fā)酵工程與發(fā)酵工程制藥的發(fā)展歷史 二、微生物發(fā)酵制藥的研究范圍 微生物菌體發(fā)酵：如香菇類、靈芝、金針菇、依賴蟲蛹而生有的冬蟲夏草菌以及與天麻共生的密環(huán)菌等藥用真菌。 微生物酶發(fā)酵： 微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵： 微生物轉化發(fā)酵： 第二節(jié) 微生物工業(yè)用菌種 一、發(fā)酵工業(yè)對生產(chǎn)菌種的要求 （1）能在易得、價廉的原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高。目標產(chǎn)物最好能分泌到胞外，以降低產(chǎn)物抑制并利于產(chǎn)物分離。 （2）發(fā)酵條件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。 （3）菌種生長和發(fā)酵速度較快，發(fā)酵周期短。 （4）根據(jù)代謝控制的要求，選擇單產(chǎn)高的營養(yǎng)缺陷型突變菌株或調節(jié)突變菌株或野生菌株。 （5）抗雜菌、抗噬菌體能力強。 （6）菌種純粹，遺傳性狀穩(wěn)定（不易變異退化），以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品質量的穩(wěn)定性。 （7）菌體不是病源菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質和毒素以保證安全。 二、工業(yè)上常用的微生物 1.微生物的共同特性 （1）個體小、構造簡單；（2）容易培養(yǎng)、易于代謝；（3）生長旺盛、繁殖迅速；（4）適應性強、容易變異；（5）分布廣泛、種類繁多。 2.工業(yè)上常用的微生物 發(fā)酵工業(yè)上常用的微生物有細菌、酵母菌、霉菌和放線菌四大類群。 三、生產(chǎn)用菌種的保藏及選育 1.菌種保藏（菌種的保藏方法） （1）斜面低溫保藏法。（2）液體石蠟保藏法。（3）砂土管保藏法。（4）冷凍干燥保藏法。（5）液氮超低溫凍結法。（6）硅膠保藏法。 2.菌種選育 （1）自然選育－－利用菌種的自發(fā)突變，從而選育出優(yōu)良菌種的過程，叫做自然選育。 （2）誘變育種－－誘變育種是指用人工的方法處理微生物，使它們發(fā)生突變，再從中篩選出符合要求的突變菌株，供生產(chǎn)和科學實驗用。 誘變劑有物理誘變劑（如紫外線、X射線、γ射線、快中子）、化學誘變劑（如亞硝酸、硫酸二乙酯、氮芥、硫酸）等。在生產(chǎn)實踐上，選用哪種誘變劑、劑量大小、處理時間等，都要視具體的情況和條件，并經(jīng)過預備實驗后才能確定。 （3）雜交育種 （4）原生質體融合 （5）基因工程育種 第三節(jié) 培養(yǎng)基及其制備 1.根據(jù)培養(yǎng)基的用途分為基礎培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。 2.發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中選擇培養(yǎng)基的基本原則 （1）必須提供合成微生物細胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分； （2）所用的單位營養(yǎng)物質能產(chǎn)生最大量的微生物菌體或發(fā)酵產(chǎn)物； （3）能形成最大濃度的微生物菌體或產(chǎn)物； （4）能形成最大產(chǎn)物生成率，從而縮短發(fā)酵周期； （5）盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化； （6）對生產(chǎn)中除發(fā)酵以外的其他方面如通氣攪拌、精制、廢棄物的處理等所帶來的困難最少； （7）原料價格低廉、質量穩(wěn)定、取材容易。 3.消毒與滅菌的區(qū)別 1.消毒（Disinfection）：用物理或化學方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死細菌芽孢，如巴氏消毒法。 2.滅菌（Sterilization）（更徹底）：用物理或化學方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽胞和孢子。 試題： 1.基因工程制藥中工程菌分為兩大類，原核細胞有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌；真核細胞有酵母、絲狀真菌。（P21） 2.基因工程藥物研究中常用的表達載體pBV220系統(tǒng)、pET系統(tǒng)。（P23） 3.酶的化學修飾：通過主鏈的切割、剪接和側鏈基團的化學修飾對酶蛋白進行分子改造，以改變其理化性質及生物活性。這種應用化學方法對酶分子實施種種“手術”的技術稱為酶分子的化學修飾。從廣義上說，凡涉及共價鍵或部分共價鍵的形成或破壞的轉變都可看做是酶的化學修飾。從狹義上說，酶的化學修飾則是指在較溫和的條件下，以可控制的方式使一種酶同某些化學試劑起特異反應，從而引起單個氨基酸殘基或其功能基團發(fā)生共價的化學改變。（P242） 4.影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素？（P24） （1）外源基因的劑量。 （2）外源基因的表達效率。①啟動子的強弱；②核糖體結合位點的有效性；③SD序列和起始密碼的間距；④密碼子組成。 （3）表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性。 （4）細胞的代謝負荷。 （5）工程菌的培養(yǎng)條件。 5.基因工程制藥中，根據(jù)真核基因在原核細胞中表達的特點，表達載體必須具備哪些條件？（P22） （1）載體能夠獨立地復制。 （2）應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選。而且克隆位點應位于啟動子序列后，以使克隆的外源基因得以表達。 （3）應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別。 （4）應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄。 （5）應具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉錄克隆的外源基因，而不轉錄其他無關的基因，同時很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。 （6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列，以便轉化后能順利翻譯。 6.以環(huán)糊精為例，說明模擬酶的作用。（P236）（重點?。?