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大豆蛋白的提取及與含量測定 在此處鍵入歡迎信息 長短均可 最好包括本站點(diǎn)的內(nèi)容簡介 一 目的要求 1 學(xué)習(xí)掌握離心機(jī) 752N 天平的使用方法和注意事項(xiàng) 2 學(xué)習(xí)掌握大豆蛋白的提取及制備丙酮干粉的原理和方法 3 學(xué)習(xí)計(jì)算蛋白質(zhì)收率 測定蛋白質(zhì)含量 二 實(shí)驗(yàn)原理 一 1 大豆蛋白的等電點(diǎn)為4 5 5 0是酸性蛋白 盡管大豆中含有水溶蛋白 鹽溶蛋白 堿溶蛋白和醇溶蛋白 但其主要成分為堿溶蛋白 本實(shí)驗(yàn)為節(jié)省丙酮用量只進(jìn)行堿提 2 丙酮 有機(jī)溶劑 可降低溶液的介電常數(shù) 破壞蛋白質(zhì)的水化膜 故可使蛋白質(zhì)在一定條件下沉淀析出 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值到等電點(diǎn)附近 有利于蛋白質(zhì)的沉淀 三 試劑 材料及儀器 1 0 2 的NaOH 2 6mol L的HCl 3 1mol L的HCl4 化學(xué)純級丙酮5 市售大豆粉6 精密pH試紙7 天平8 離心機(jī) 普通 9 離心內(nèi) 外套管10 燒杯11 攪拌棒 四 實(shí)驗(yàn)步驟 提取 稱取3克大豆粉 用0 2 NaOH30毫升 先加入調(diào)成糊狀 再用少量多次地慢慢地加入 邊加邊攪拌 NaOH溶液 室溫下攪拌抽提15min 于6000r min離心7min 小心留取上清液 棄脂層和沉淀 如上清液有漂浮物 再經(jīng)過濾 留出上清液2毫升稀釋50 100倍做含量測定 三 實(shí)驗(yàn)步驟 制干粉 量上清液的體積 加入等體積在冰箱中預(yù)冷的丙酮 先用6mol L的HCl調(diào)pH至6 0 再用1mol L的HCl小心調(diào)pH至4 5 5 0 于4000r min離心15min 留取沉淀物 并用少量丙酮反復(fù) 至少兩次 攪拌洗滌 在離心管中進(jìn)行 加入丙酮后一定將沉淀攪拌充分 加入丙酮目的使沉淀脫水 得到白色粉末狀的大豆蛋白粉 上清液回收 用干凈的濾紙吸干 平鋪在表面皿上 放入40度烘箱干燥 待整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后 再稱重并計(jì)算產(chǎn)率 Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量 目的要求掌握Folin酚法測定蛋白濃度的原理和方法實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)濃度可以從它們的物理化學(xué)性質(zhì) 如比重 紫外吸收 折射率等測定而得知 或用化學(xué)方法 如定氮 雙縮脲反應(yīng) Folin酚試劑反應(yīng)等方法來計(jì)算 其中雙縮脲法和Folin酚法是一般實(shí)驗(yàn)室中常用的方法 它們操作簡便 迅速 不需要復(fù)雜而昂貴的儀器 Folin酚法靈敏度高 比雙縮脲法靈敏100倍 Folin酚法所用試劑是由兩部分組成 試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑 可與蛋白質(zhì)中的肽鏈起顯色反應(yīng) 試劑乙中的磷鉬酸和磷鎢酸在堿性條件下不穩(wěn)定 易被酚類還原而呈蘭色 鉬蘭和鎢蘭混合物 由于蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酪氨酸還原呈蘭色 溶液蘭色的深淺與蛋白濃度有較好的線性關(guān)系 因此用Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量 靈敏度較高 樣品中含酚類化合物及檸檬酸均有干擾作用 如果樣品酸度較高則顯色較淺 要提高碳酸鈉一氫氧化鈉的濃度 此法也可測定溶液中酪氨酸的色氨酸的濃度 Folin酚法有不少具有操作方法 但基本原理都是一個(gè) 只是在各溶液的濃度及填加量上 保溫的溫度及保溫時(shí)間上有所不同而已 本實(shí)驗(yàn)所介紹的是本室常用的 靈敏度較高的操作方法 試劑和器材 1 材料 本實(shí)驗(yàn)所提取大豆蛋白水提取液 經(jīng)合適稀釋至可測定范圍 2 試劑 1 0 03mol LPH7 8的磷酸緩沖液 2 200 g ml的標(biāo)準(zhǔn)酪 牛血清 蛋白溶液 3 Folin試劑甲 俗稱堿性銅試劑 10gNaoH溶于400ml水中 再加50gNa2CO3 稱取0 5g酒石酸鉀鈉溶于80mlH2O中 再加0 25gCuSO4 以上兩溶液混合定容到500ml 冰箱保存可用一個(gè)月 4 Folin試劑乙 在2升磨口回流裝置的燒瓶內(nèi) 加鎢酸鈉 NaWO4 2H2O 100g 鉬酸鈉 NaMoO 2M2O 25g 蒸餾水700ml 85 的磷酸50ml 濃鹽酸100ml 充分混合后 小火回流10小時(shí) 再加硫酸鋰 Li2SO4 150g 蒸餾水50ml及數(shù)滴溴 然后開口沸騰15min 以驅(qū)除過量的溴 冷卻后定容到1000ml 過濾后呈金黃色 于棕色并中保存 可使用多年 上述制備的Folin試劑乙的貯備液濃度一般在2mol L左右 幾種操作方案都是把Folin試劑乙稀釋至1mol L的酸度作為應(yīng)用液 我們是把貯備液于作用前稀釋18倍 使之濃度為0 1mol L略高 這種稀釋18倍后的Folin試劑乙就是下文稱之為應(yīng)用液 Folin試劑乙貯備液濃度的標(biāo)定 一般是以酚酞為指示劑 用Folin試劑乙去滴定1mol L左右的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液 當(dāng)溶液顏色由紅變?yōu)樽匣疑?再突然變成黑綠既為終點(diǎn) 如果用NaOH去滴定Folin乙 終點(diǎn)不太好掌握 溶液的顏色是由淺黃色變?yōu)闇\綠色 再變?yōu)榛易仙珵榻K點(diǎn) 3 器材 試管10支試管架一個(gè)移液管 5ml 1ml 移液管架洗瓶恒溫水浴752N型分光光度計(jì) 操作方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液 用0 03mol L的磷酸緩沖液溶解的酪蛋白 濃度為200 g ml 用一支0 5ml移液管分別取上述標(biāo)準(zhǔn)酪蛋溶液0ml 0 1ml 0 2ml 0 4ml 0 6ml 0 8ml 1 0ml各加到一支試管中去 將此吸管用0 03mol LPH7 8的磷酸緩沖液 反復(fù)洗凈 再用同一支移液管 防止未經(jīng)標(biāo)定吸量管的相對誤差的影響 取上述緩沖液將每支試管中的溶液補(bǔ)加至1ml 再在另一支試管中加入1ml緩沖液作空白對照 于上述試管中各加入1mlFolin試劑甲并不時(shí)地進(jìn)行振蕩 10min后再加入后1in試劑乙的應(yīng)用液4毫升 立既搖勻放入55 水溶中保濕5min 取出后用自來水冷卻1min 于波長650nm進(jìn)行比色測定各管的OD值 以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo) OD值為縱坐標(biāo) 既可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線 Folin 酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作 取7支試管 干燥的 按下表順序分別加入各種試劑并進(jìn)行反應(yīng)和測定 2 樣品測定 取兩支試管 平行 各加入待測的蛋白質(zhì)樣品液1ml 不加buffer 其他操作同工作曲線 可取兩支試管編號8 9 與工作曲線同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)和比色測定 蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算 A650值對應(yīng)的mg數(shù) Pr Pr mg ml 稀釋倍數(shù)Pr溶液的ml數(shù) 思考題1 采用Folin的酚法測定樣品的蛋白質(zhì)含量時(shí) 樣品中的什么物質(zhì)對測定結(jié)果有干擾 2 作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白的酪蛋白在應(yīng)用時(shí)有何要求 五 注意事項(xiàng) 一 使用離心機(jī)的方法及注意事項(xiàng) 離心機(jī)的工作原理是 在離心力場的作用下 可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度 從而將不同的物質(zhì)分離 離心機(jī)是生化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用于提取 分離 純化的常用設(shè)備 其操作中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是平衡 具體的使用方法及注意事項(xiàng)如下 由在各室上課的教師結(jié)合本室離心機(jī)進(jìn)行現(xiàn)場指導(dǎo) 五 注意事項(xiàng) 離心機(jī)使用注意 1 檢查離心內(nèi) 外套管應(yīng)完整不漏 洗凈離心管 2 待離心的物質(zhì)裝入離心管的量不應(yīng)超過離心內(nèi)套管體積的2 3 3 將一對離心管 含內(nèi) 外套管 放在臺秤上平衡 可調(diào)節(jié)離心管內(nèi)容物的量 也可在內(nèi) 外管間加水緩沖平衡 4 檢查離心機(jī)可正常工作后 將一對平衡好的離心管按對稱的位置放在離心機(jī)中 5 蓋好離心機(jī)蓋 打開電源開關(guān) 慢慢撥動變速旋鈕 從0開始 使速度逐漸增加 記時(shí) 離心結(jié)束后 一定先將變速旋鈕慢慢撥到0位 再關(guān)電源 待離心機(jī)停止運(yùn)轉(zhuǎn)后 再打開離心機(jī)蓋 取出離心管 不許用手強(qiáng)行使離心機(jī)停止轉(zhuǎn)動 6 用完后 將內(nèi)外套管洗凈 倒立放置 使其干燥 并在使用的登記薄簽名 7 使用過程中 如出現(xiàn)故障 一定請本室的實(shí)驗(yàn)員排除 不許擅自處理 制丙酮干粉時(shí)的注意事項(xiàng) 加入丙酮及加酸調(diào)pH時(shí) 都要邊加邊攪丙酮一定要遠(yuǎn)離明火調(diào)pH時(shí) 不許調(diào)過頭 制丙酮干粉 要少量多次加入丙酮后 將沉淀充分?jǐn)嚻?