凝膠電泳緩沖液及配制.doc
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2測(cè)序凝膠加樣緩沖液 98%去離子甲酰胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青FF0.025%溴酚藍(lán)甲酰胺:許多批號(hào)的試劑級(jí)甲酰胺,其純度符合使用要求,無(wú)須再進(jìn)行處理。不過(guò),一旦略呈黃色,則應(yīng)用在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹(shù)脂共同攪拌1小時(shí)進(jìn)行去離子處理,并用Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾2次,去離子甲酰胺分裝成小份,充氮存于-70。3常用的電泳緩沖液 緩沖液使用液濃貯存液(每升)Tris-乙酸(TAE)1:0.04mol/L Tris-乙酸50:242g Tris堿0.001mol/L EDTA57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-磷酸(TPE)1:0.09mol/L Tris-磷酸10:10g Tris堿0.002mol/L EDTA15.5ml85%磷酸(1.679g/ml)40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸(TBE)a0.50.045mol/L Tris-硼酸5:54g Tris堿0.001mol/L EDTA27.5硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)堿性緩沖液b1:50mmol/L NaOH1:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1:25mmol/L Tris5:15.1g Tris250mmol/L 甘氨酸94g 苷氨酸(電泳級(jí))(pH8.3)0.1% SDS50ml 10% SDS(電泳級(jí))說(shuō)明:TBE溶液長(zhǎng)時(shí)間存放后會(huì)形成沉淀物,為避免這一問(wèn)題,可在室溫下用玻璃瓶保存5溶液,出現(xiàn)沉淀后則予以廢棄。以片都以1TBE作為使用液(即1:5稀釋濃貯液)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1:10稀釋的貯存液作為使用液。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小, 故通過(guò)緩沖液的電流量通常較大,需要使用1TBE以提供足夠的緩沖容量。堿性電泳緩沖液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。Tris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。42SDS凝膠加樣緩沖液 100mmol/L TrisHCl(6.8)200mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)4%SDS(電泳級(jí))0.2%溴酚藍(lán)20%甘油不含DTT的2SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫,應(yīng)在臨用前取1mol/L貯存液現(xiàn)加于上述緩沖液中。5凝膠加樣緩沖液 緩沖液類(lèi)型6緩沖液貯存溫度0.25%溴酚藍(lán)40.25%二甲苯青FF40%(W/V)蔗糖水溶液0.25溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(Ficoll400)0.25%溴酚藍(lán)40.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液0.25%溴酚藍(lán)440%(W/V)蔗糖水溶液堿性加樣緩沖液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18%聚蔗糖(Ficoll400)40.15%溴甲酚綠0.25%二甲苯青FF使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三:增大樣品密度;以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi);使樣品呈現(xiàn)顏色,從而使加樣操作更為便利,含有在電塊中能以可預(yù)知速率向陽(yáng)極泳動(dòng)的染料。溴酚藍(lán)在瓊脂糖中移動(dòng)的速率約為二甲苯青FF的2.2倍,而與瓊脂糖濃度無(wú)關(guān)。以0.5TBF作電泳液時(shí),溴酚藍(lán)在瓊脂糖中的泳動(dòng)速率約與長(zhǎng)300bp的雙鏈線(xiàn)狀DNA相同,而二甲苯青FF的泳動(dòng)則與長(zhǎng)4kb的雙鏈線(xiàn)狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%1.4%的范圍內(nèi),這些對(duì)應(yīng)關(guān)系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。選用哪一種加樣染料純屬個(gè)人喜惡。但是,對(duì)于堿性凝膠應(yīng)當(dāng)使用溴甲酚綠作為示蹤染料,因?yàn)樵趬A性pH條件下其顯色較溴酚更藍(lán)為鮮明。- 1.請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來(lái)的問(wèn)題本站不予受理。
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